2017年诺贝尔化学奖授予三位冷冻电镜领域的学者瑞士洛桑大学的雅克·杜波切特 （Jacques Dubochet）、美国哥伦比亚大学的乔基姆·弗兰克（Joachim Frank）和 英国剑桥MRC分子生物学实验室的理查德·亨德森（Richard Henderson），奖励 他们对冷冻电镜技术的发展做出的原创性贡献。

文/尹长城(北京大学医学部生物物理学系教授、分析中心电镜室主任、中国生物物理学会冷冻电镜分会副理事长、中国电子显微学会低温电镜专业委员会主任)

要想了解冷冻电镜是何方神器，首先要了解结构生物学。

分子生物学时代的“利器”

结构生物学是应用物理学方法在原子水平阐明生物大分子的三维结构及其动态变化，进而诠释生物大分子的生物学功能及其执行功能的工作机制的科学。

结构生物学起源于理查德·亨德森所在的英国剑桥MRC分子生物学实验室(MRC Laboratory of MoIecular Biology, 简称MRC-LMB)，于上个世纪30年代开始于马克斯·佩鲁茨(Max Perutz)和约翰·肯德鲁(John Kendrew)以及吉姆·沃森(Jim Watson)和弗朗西斯·克里克(Francis Crick)应用X-射线晶体学方法研究蛋白质(血红蛋白)和DNA的结构。

正是血红蛋白的结构解析和DNA双螺旋结构的破解导致了生物学的革命——生命科学从对生命现象的定性宏观描述阶段，进入了对生命现象的分子机制的微观描述阶段，即进入了分子生物学时代。马克斯·佩鲁茨(Max Perutz)和约翰·肯德鲁(John Kendrew)因此获得1962年诺贝尔化学奖，吉姆·沃森和弗朗西斯·克里克也获得了同年的诺贝尔生理学及医学奖。

冷冻电镜(cryo-electron microscopy, 简称cryo-EM)作为一种结构生物学技术，其解析结构的方法是通过电子显微镜对冷冻固定在玻璃态的冰中的生物大分子进行成像，然后应用计算机对所摄取的生物大分子图像进行图像处理和计算，进而重构出生物大分子的三维结构。

▲当年轰动世界的DNA双螺旋结构的发现，就是因为研 究出了利用X射线去研究DNA 的衍射的方法。

带来了结构生物学的一场革命

冷冻电镜结构解析的理论基础是电镜三维重构原理，由MRC分子生物学实验室的亚伦·克卢格(Aaron Klug)及其同事戴维德·罗斯特(David DeRosier)于1960年代建立。

该原理基于数学中的傅立叶变换相关的中央截面定理和傅立叶变换的性质，将这一原理应用于电镜图像：一个物体(如蛋白质、病毒、细胞器、细胞)的三维结构的不同方向所摄取的n个电镜图像的傅立叶变换的集合等价于该物体三维结构的三维傅立叶变换，对此三维傅立叶变换做逆傅立叶变换等价于恢复原物体的三维结构。

通俗来说，一个苹果，它本身是三维的，我们拿二维照相机多方位、多角度地拍很多张照片，就能重构出苹果的三维模型。从这个角度来看，冷冻电镜就相当于一个照相机，当选好的冷冻样品被送到冷冻电镜时，会生成很多图像，这些图像组合起来便可以构建一个三维结构。

这个原理奠定了电镜解析物体三维结构的基石，所有用电镜解析物体三维结构的方法都是基于这个原理。由于这一贡献，亚伦·克卢格荣获1982年诺贝尔化学奖。

虽然亚伦·克卢格及其同事早在1960年代就提出了电镜三维重构原理，但由于当时如何保持生物大分子的结构信息并用电镜收集这些信息再用计算机对这些信息进行处理的技术还不成熟，因此，截止到2013年，只有在平面形成一层高度有序排列的蛋白质分子样品(在电镜领域称为“二维晶体”，two-dimensional crystal)才能应用冷冻电镜解析结构。

2013年以后，由于冷冻电镜关键技术的突破，使得分散的蛋白质分子样品(在电镜领域称为“单颗粒”，single particle)也能应用冷冻电镜解析结构。可以说冷冻电镜关键技术的突破性进展，导致结构生物学发生了革命。在此过程中，雅克·杜波切特、乔基姆·弗兰克和理查德·亨德森做出了开创性的贡献。

▲冷冻电镜三维 重构得到的电子云 密度图和原子模型（局部）

解决了给生物大分子“照相”的两大难题

那么如何保持生物大分子的结构信息?

1974年，美国加州大学伯克利分校劳伦斯·伯克利(Lawrence Berkeley)实验室的罗伯特·格莱斯(Robert Glaeser)及其学生肯尼思·泰勒(Kenneth Taylor)发现，如果把生物大分子catalase的二维晶体快速冷冻，他们观察到晶体的电子衍射可到3，即原子分辨率，说明快速冷冻可保持生物大分子的结构信息。但由于生物大分子的二维晶体很难获得，因此以二维晶体为材料解析结构的方法难以推广，急需发明一个以非晶的生物大分子(称为单颗粒，single particle)为材料的普适性方法。

1984年，当时在德国欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory, 简称EMBL)工作的雅克·杜波切特受到格莱斯工作的启发，把非晶的生物大分子(二十面体病毒)直接在电镜载网上形成薄膜并快速冷冻，发现如此冷冻的生物大分子同样可以保持结构信息。雅克·杜波切特的开创性工作因此导致了今天广泛应用的单颗粒冷冻电镜技术的诞生。

如何从冷冻在一层薄冰中的生物大分子电镜图像中提取结构信息，是应用冷冻电镜技术解析结构的另一个需要解决的关键问题。这个问题上，乔基姆·弗兰克对此做出了开创性贡献。

早在雅克·杜波切特发明生物大分子单颗粒快速冷冻方法之前，乔基姆·弗兰克就探讨了如何从分散在电镜载网上的生物大分子单颗粒电镜图像提取结构信息的图像处理和三维结构计算方法，并研发了第一个软件包SPIDER。

此后，又有多个学者研发了针对冷冻电镜生物大分子单颗粒电镜图像处理和三维结构计算方法并开发了相应的软件包，如美国贝勒医学院史提夫吕特克(Steve Ludtke) 和美国国家科学院院士赵华(Wah Chiu)研发的EMAN，美国布兰迪斯大学尼古拉·格里戈列夫(Nicola Grigorieff)(曾在英国剑桥MRC分子生物学实验室理查德·亨德森实验室做博后)研发的FREALIGN和英国剑桥MRC分子生物学实验室舍尔斯(Sjors Scheres)研发、目前广泛使用的RELION。

虽然由于快速冷冻技术和电镜单颗粒图像处理技术的发明，使得应用生物大分子单颗粒冷冻电镜可以解析结构，但是还有一些关键问题没有解决，限制了冷冻电镜解析结构到原子分辨率。

2004年，理查德·亨德森对冷冻电镜单颗粒技术做了理论分析，指出冷冻电镜单颗粒技术理论上完全可以将结构解析到原子分辨率，并针对给生物大分子“照相”时出现的“像素太低”和“动来动去”的情况，指出了技术上需要克服的关键问题：第一是提高冷冻电镜图像的信噪比，第二是克服冷冻电镜图像在摄像时的漂移。理查德·亨德森的理论分析为冷冻电镜的发展指明了方向，并提出了解决问题的方案。

2013年，美国加州大学旧金山分校的旅美华人学者程亦凡与大卫·阿加德(David Agard)(曾在英国剑桥MRC分子生物学实验室理查德·亨德森实验室做博士后)把直接电子探测器(direct detection device，简称DDD)用于冷冻电镜单颗粒电镜图像记录。

DDD直接记录电子信号，降低了点扩散效应，由于无需电子-光学信号转换，保持了原始信号的强度。因此，用DDD记录的图像分辨率高、信噪比高、信号强。由于DDD摄取的电镜图像信号强、信噪比高，因此可对图像产生的漂移进行校正后叠加平均，消除由于样品漂移导致的图像模糊，提高了电镜图像的分辨率。

DDD的引入，同时克服了理查德·亨德森指出的技术上需要克服的两个关键问题，实现了冷冻电镜单颗粒技术将结构解析到原子分辨率的梦想。

▲ 冷冻电镜技术 和单颗粒重构技术 越来越备受关注 ( 统计数据来源于 EMDataBank )